Возможности конфокальной микроскопии.(Предварительное сообщение)

Конфокальная микроскопия: от исследования до практического применения

Возможности конфокальной микроскопии.(Предварительное сообщение)

Значительная часть проводимых на биологическом факультете МГУ научных исследований, успешная реализация тесно связанных с ними образовательных программ, немыслимы без применения самой современной микроскопической техники. В рамках Программы развития Московского университета на биологическом факультете была создана, полностью оснащена необходимым оборудованием и эффективно работает межкафедральная лаборатория конфокальной микроскопии.

Третьяков Артемий

Что может делать?

С помощью конфокального микроскопа можно получить несколько изображений виртуальных срезов клетки, или же собранную из них трехмерную модель. Такие возможности дает лазер, луч которого можно фокусировать в любой точке клетки.

Для получения изображения объект должен быть флуоресцентно активен, то есть при попадании луча лазера он (а точнее, определенные молекулы в его составе) должен испускать свет с большей длиной волны, чем попадающий на него, который и улавливается микроскопом.

Изображение строится как раз на основе этой флуоресценции.

Фото: Клетки костного мозга на матриксе из регенерированного фиброина шелка. Ядра выявлены SYBR Green, показаны зеленым.

Gr-1 (granulocyte differentiation antigen 1) выявлен антителами к Gr-1, конъюгированными с PE, показан красным. Изображение получено с использованием конфокальной системы Nikon A1 в рамках совместной работы д.

б.н. Недоспасова С.А., к.б.н. Друцкой М.С. и к.б.н. Мойсеновича М.М.

Как работает?

«Современный уровень развития фундаментальных и прикладных междисциплинарных научных исследований, а также задачи подготовки специалистов, обладающих междисциплинарными компетенциями, требуют интенсивного развития и модернизации материально-технической базы» (Программа развития Московского университета, стр. 5;).

Кроме лазера в состав электронномеханического устройства входит также оптический фильтр, пропускающий луч лазера, но отражающий более длинноволновый свет на диафрагму, называемую «пинхолом» (от англ.

Pinhole – проделанная булавкой дырка, дословный перевод отлично характеризует устройство пинхола), которая отсекает весь ненужный фоновый свет и тем самым снижает или вовсе сводит на нет влияние нижележащих оптических слоев на четкость отображения сканируемого участка клетки.

Если бы фоновый свет не отсекался пинхолом, то оптические слои накладывались бы друг на друга и мешали наблюдателю – будто бы он смотрит сквозь листву вдаль. За диафрагмой располагается фотоприемник, оцифровывающий получаемую информацию.

Понятно, что такое «точечное» сканирование требует времени. Чтобы ускорить этот процесс в конфокальной системе используется еще один модуль, называемый спиннинг-диском, позволяющий за один акт работы лазера получить изображение не одной точки, а целой линии.

Патент на такую систему был получен в 1961 году профессором Массачусетского технологического института Марвином Минским. Активное ее использование началось в 80-х годах, а сейчас конфокальная микроскопия переживает свой расцвет.

В России первый микроскоп появился в 2003 году, это был Axiovert 200M LSM510 Meta. За ним последовали другие, и теперь в нашей стране существует несколько крупных лабораторий, в числе которых и межкафедральная лаборатория на биологическом факультете МГУ.

В распоряжении лаборатории пять микроскопов, в том числе: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках. Для этих целей каждая установка снабжена системами поддержания их жизни. Все это дает широкие возможности для исследователей, которые этими возможностями с успехом пользуются.

И, раз уж речь идет о лаборатории биологического факультета МГУ, в качестве примеров следует упомянуть проведенные в этой лаборатории исследования.

Шелк и паутина

Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках.

Одной из интересных работ является создание биодеградируемых протезов для восстановления сосудов и других полых органов. Такие тканеинженерные конструкции внешне представляют собой, в наиболее простых случаях, трубки или пленки, надевающиеся на место повреждения и выполняющие, таким образом, роль «заплатки».

Их можно изготовить из разных материалов, в том числе из фиброина шелка коконов шелкопряда. Достоинство этого материала в том, что он стабилен и формирует гибкую и прочную структуру протеза.

Сам протез выглядит как пленка только при рассмотрении невооруженным глазом, на самом деле он представляет собой матрикс –  сетчатую многослойную основу, каркас, имитирующий строение живой ткани. Этот каркас помогает новым клеткам занять правильное положение, обеспечивая их равномерное распределение.

В результате поврежденная стенка органа восстанавливается, а ставший ненужным каркас подвергается биодеградации.

Но проверить, насколько равномерно распределяются по каркасу клетки, а также хорошо ли им живется в глубоких слоях матрикса (нет ли затруднений в газообмене и обмене продуктами метаболизма), и не изменяют ли они при проникновении внутрь него морфологии, не так-то просто. Именно на этом этапе применение микроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) сильно упростило задачу. В основном за счет возможности исследовать объект без разрушения, а также за счет способности микроскопа смотреть внутрь матрикса на глубину до 600 мкм.

Фото: Фибробласты 3Т3 на стенках макропоры матрикса. Оптический срез в 50 мкм от поверхности матрицы. Матрикс выявлен TRITC (показан красным), ядра фибробластов выявлены SYTOX (показаны зеленым). Изображение получено с использованием микроскопа Axiovert 200M с конфокальной приставкой LSM510 META (с разрешения М.М.Мойсеновича).

Похожие работы были проведены и с костной тканью, матрикс для которой изготавливали как из того же фиброина, так и из спидроина –  белка, изначально обнаруженного в организме паука и использующегося им для плетения паутины. В лабораторных условиях белок производят совсем не пауки, а дрожжи, в чей геном внедрен немного измененный ген паука, ответственный за синтез этого белка.

Не все так просто

Но, если возникновение повреждений в тканях – процесс простой и понятный, другие патологии понятны далеко не всегда. И прежде чем начать эффективное лечение и, тем более, предотвращение их развития, нужно выяснить механизм их возникновения.

К числу таких относится атеросклероз – болезнь артерий, в результате которой в стенке сосуда, а точнее, в интиме – ее внутреннем слое, накапливаются липиды, делающие стенку толще, что в конечном итоге может привести даже к полной закупорке сосуда.

Из-за чего возникает это заболевание, не совсем понятно, как и непонятно то, какую роль играют иммунокомпетентные клетки, в местах скопления которых вскоре начинается атерогенез.

Полноценные ответы на эти вопросы еще не найдены, но изучение атерогенеза продолжается, хоть и публикаций на эту тему куда меньше, чем на тему тканеинженерных протезов.

Фото: Структура стенки поры матрицы из спидроина 1. Оптический срез на расстоянии 50 мкм от поверхности матрицы. (О.Л. Пустовалова, М.М. Мойсенович, П.С. Еремин, А.Ю. Архипова, А.А.

, Рамонова, О.С. Соколова, В.Г. Богуш, И.И. Агапов, М.П. Кирпичников. Культивирование клеток на трехмерной матрице из рекомбинантного спидроина 1. Российский иммунологический журнал, 3(2):139-146, 2009.

)

Судьбы молекул

Межкафедральную лабораторию конфокальной микроскопии регулярно используют в своей работе более 20 студентов и аспирантов с почти 10 кафедр.

В описанных выше исследованиях в основном отслеживается состояние клеток. Но этим возможности конфокального микроскопа не ограничены, он вполне способен отследить даже судьбу отдельной молекулы в клетке – лишь бы она обладала флуоресцентной активностью. Для этого молекулы обычно метят флуорохромами – специальными красителями, имеющими эту активность.

Флуорохромы существуют в виде отдельных молекул, и мечение ими заключается в химическом связывании флуорохрома с интересующей исследователя молекулой. После этого такие меченые молекулы попадают в клетку и их дальнейшую судьбу отслеживают при помощи микроскопа. Таким способом сравнивали, например, активность и перемещения в клетке рицина и вискумина.

Оба вещества – белковые токсины, оба имеют растительное происхождение и состоят из двух частей – субъединиц, одна из которых ответственна за связывание с клеткой и проникновение внутрь, а другая – за инактивацию рибосомы, что в конечном итоге ведет к гибели клетки. Практическая польза опять же связана с лечением еще одного опасного заболевания – рака.

Такое четкое «разделение обязанностей» между субъединицами позволяет заменить первую субъединицу, например, на антитело. Получится «иммунотоксин», действующий только на определенные клетки, к которым это антитело подойдет. Основных проблем две. Первая: выбор антитела, которое будет подходить к раковым клеткам и не допускать проникновения токсина в здоровые.

И вторая: выбор токсина, который при превращении в иммунотоксин будет сохранять высокую эффективность.

Фото: Первичная культура клеток сердца новорожденных крысят: А – контроль, Б – обработанных 20мкМ изопротеренола в течении суток. 1 – окраска митохондрий TMRE; 2 – фазовый контраст. Шкала 10мкм. (Смирнова Т.А.

, Сапрунова В.Б. “Адаптационные изменения митохондрий культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крысят под воздействием изопротеренола”. Международная конференция “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” 24-26 МАЯ 2011г. Пущино).

Обучение

Список проведенных с использованием конфокальной микроскопии работ можно продолжать долго.

Эффективный метод, к тому же позволяющий работать с живыми клетками, востребован практически в любом научном исследовании. И поэтому огромную роль играет подготовка студентов к работе в этой лаборатории.

Регулярно ее посещают более 20 студентов и аспирантов, занимающихся курсовыми, предкурсовыми и дипломными работами.

Работают на установках эмбриологи, молекулярные биологи, цитологии, биоинженеры, иммунологи, зоологи.

Лаборатория конфокальной микроскопии основана в 2004 году.

Заведующий лабораторией – доцент М.М.Мойсенович

В лаборатории работают молодые специалисты А.А.Рамонова и А.Ю.Архипова

В настоящее время в лаборатории установлены 2 конфокальные системы:

  • Axiovert 200M с конфокальной приставкой LSM510 META (Carl Zeiss, Германия)
  • Конфокальная лазерная сканирующая система, производства “НИКОН КОРПОРЕЙШН” (Япония) – микроскоп медико-биологический  инвертированный для лабораторных исследований Eclipse с принадлежностями:  со штативом Ti-E, с TIRF-осветителем, с конфокальным модулем А1 и конфокальным модулем на основе спиннинг-диск.

Источник: http://www.bio.msu.ru/news/view.php?ID=712

Конфокальная микроскопия. Принцип действия, примеры исследования

Возможности конфокальной микроскопии.(Предварительное сообщение)

Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света.

В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта.

Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы.

После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

Описание метода конфокальной микроскопии

Благодаря конфокальной флуоресцентной микроскопии появилась возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности.

По сравнению с ксеновыми или ртутными лампами лазеры отличаются существенными преимуществами, так как обладают способностью монохроматичности, а также высокой параллельности испускаемого пучка света. Такие свойства лазерного излучения обеспечивают оптической системе более эффективную работу, а также снижают количество бликов и увеличивают точность фокусировки пучка света.

На исследуемом образце лазер освещает не все поле зрения, а фокусируется в определенной точке. Конфокальная диафрагма позволяет избавиться от внефокусной флуоресценции, при этом изменяя диаметр диафрагмы, можно точно определять толщину оптического слоя возле фокуса лазерного луча. Благодаря описанному свойству конфокальная микроскопия позволяет получать улучшенное разрешение вдоль оси Z.

Специальные программы, которыми оснащены конфокальные микроскопы, позволяют из серии оптических срезов создавать объемные изображения объектов, а также рассматривать их под разными углами зрения.

Применение мультиспектрального лазерного сканирующего конфокального микроскопа дает возможность изучать колоколизацию в клетке различных веществ. Мультиспектральный режим позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования по методу FISH.

Примеры исследований, проводимых с помощью конфокального микроскопа

Конфокальная микроскопия помогает изучать способность различных веществ накапливаться в ядре, цитоплазме или в других клеточных структурах. Эти способности зачастую применяются в процессе проведения исследований механизмов действия канцерогенов, противоопухолевых соединений, лекарственных препаратов, а также позволяют рассчитывать их эффективные концентрации.

Летальное изучение интенсивности, а также формы спектров собственной флуоресценции дает возможность распознавать воспаленные и нормальные клетки. Этот метод используется на ранних сроках диагностики рака шейки матки.

Правильно подобранная комбинация различных фильтров, предназначенных для нескольких типов собственной флуоресценции, может получаться без трудоемкого исследования множества срезов. Таким образом, можно быстро и точно обнаруживать злокачественные тканевые структуры и отличать их от нормальных.

Методы конфокальной микроскопии достаточно широко используются в гидробиологии и эмбриологии, в ботанике и зоологии в процессе изучения структуры гамет, а также развития и формирования организмов.

Конфокальные лазерные микроскопы в современном мире нашли широкое применение в области биологии, биофизики, медицины, клеточной, а также молекулярной биологии.

Конфокальная микроскопия – это уникальная бесконтактная методика, которая сегодня используется для изучения роговицы глаза.

Она позволяет максимально точно оценить имеющуюся степень клеточных изменений и внеклеточных структур, а также сделать выводы о возможном повреждении роговицы в целом.

Лазерные конфокальные микроскопы обладают высоким разрешением, поэтому позволяют исследовать структуру флуоресцентно меченых клеток и даже отдельных генов.

Применение всевозможных технологий специфической многоцветной флуоресцентной окраски для биологически активных молекул, а также надмолекулярных комплексов дает возможность изучать сложные механизмы функционирования не только отдельных клеток, но и целых систем. Данная технология широко используется в экспериментальной биологии, а также в медицине.

Оборудование – конфокальные микроскопы

Современные сверхточные конфокальные микроскопы, такие как Leica TCS SP8 позволяют получить максимально четкие и достоверные данные при проведении различных исследований. Широкий интерес к таким приборам возник в восьмидесятых годах прошлого столетия, из-за быстрого развития компьютерной техники и лазерных технологий.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия представляет собой разновидность оптической микроскопии.

Ее особенностью является то, что лазерный луч фокусируется на определенную область по осям Х и У и формирует, таким образом, изображение. Отраженный свет демонстрируется на экране в виде растра.

Размеры изображения напрямую зависят от разрешающей способности современной электроники, а также от размеров сканируемого растра.

Измерительные приборы, которые созданы с помощью современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в наше время получили широчайшее распространение в разных сферах. По сравнению с обычной световой микроскопией конфокальная микроскопия обладает следующими преимуществами:

  • улучшенная разрешающая способность;
  • высокая контрастность изображения;
  • возможность проводить мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов;
  • возможность получения «оптических срезов» с трехмерной реконструкцией;
  • возможности использования способов цифровой обработки полученных изображений;

Из недостатков описанной аппаратуры можно выделить:

  • сложность настройки прибора;
  • отсутствие оптического изображения;
  • высокая стоимость приборов, также дороговизна их обслуживания.

В конфокальном микроскопе для управления всей системой используется специальный компьютер. Он позволяет сохранять изображения и детально изучать полученные данные.

Для качественной обработки полученных изображений зачастую требуются достаточно большие вычислительные мощности, поэтому компьютер должен обладать довольно большой оперативной памятью. Для дальнейшего хранения информации требуется также и большая дисковая память.

Для передачи изображений такой компьютер должен иметь USB-порт или CD/DVDRW. Также компьютер имеет возможность подключения к глобальной интернет или локальной сети.

Программное обеспечение, установленное в таких компьютерах, может быть базовым. Оно поставляется вместе с техникой и позволяет управлять всей системой и контролировать ее основные функции.

Также для указанных компьютеров специально разрабатываются пакеты прикладных задач, которые заказываются дополнительно.

Многие модели конфокальных микроскопов имеют специальный пульт управления, позволяющий настраивать их работу дистанционно.

Устанавливают описанные приборы в обычных лабораторных посещениях. Важнейшей процедурой в процессе эксплуатации конфокальных микроскопов является контроль за вибрациями. Для таких целей применяют специальное устройство, измеряющее уровень вибрации. Процедура контроля похожа на процедуру измерения аксиальной разрешающей способности ЛСКМ при помощи зеркала.

Конфокальная микроскопия стремительно развивается.

Известные компании-производители представляют на рынке новейшие образцы конфокальных микроскопов, которые позволяют эффективно разделять лазерный луч возбуждения, а также люминесценцию.

С помощью компьютера в таких приборах управляется светоделитель. Его спектральные свойства при необходимости могут достаточно быстро перестраиваться на несколько лазерных линий.

Конфокальные микроскопы в микробиологии

Конфокальный микроскоп также незаменим в биологии для детального исследования клетки. Сегодня на эту тему публикуется огромное количество различных научных статей. Чаще всего при помощи конфокальных микроскопов изучают структуру клеток, а также их органоидов. Также исследуется колокализация в клетке для того, чтобы понять есть ли причинно-следственная связь между веществами клетки.

В процессе изучения белков конфокальными микросокпами они предварительно маркируются антителами с разными флуорохромами.

С помощью обычного классического микроскопа довольно трудно разобрать расположены ли они рядом либо же один под другим, а вот конфокальный микроскоп позволяет это сделать без особых проблем.

В памяти компьютера записываются данные о серии оптических срезов и, таким образом, проводится объемная реконструкция объекта, атакже получается его трехмерное изображение.

Также с помощью конфокальных микроскопов исследуют динамическое процессы, протекающие в живых клетках, например, передвижение ионов кальция или других веществ сквозь клеточные мембраны.

Используют конфокальные микроскопы и для изучения подвижности биоорганических молекул с помощью ионизации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения, а также последующего его рассоединения с молекулами.

Такие молекулы маркируются двумя флуорохромами, обладающими спектром испускания донора, который перекрывается спектром поглощения акцептора.

Таким образом, энергия передается от донора к акцептору на небольших расстояниях и в результате резонанса между энергетическими уровнями. После этого акцептор в видимой области спектра излучает энергию, которая впоследствии регистрируется с помощью конфокального микроскопа.

Развитие конфокальной микроскопии продолжается. Компании-производители указанного оборудования ежегодно представляют на рынке все более современные, функциональные и усовершенствованные микроскопы, позволяющие ученым совершать новые полезные открытия в самых разных сферах.

Совершенствуется и программное обеспечение, предназначенное для компьютеров, которыми оснащены конфокальные микроскопы. Оно позволяет воплощать в жизнь самые сложные задачи, которые дают возможность проводить исследования на молекулярном и клеточном уровне.

Сегодня с уверенностью можно сказать, что за конфокальными микроскопами будущее, так как по своим функциональным характеристикам и техническим возможностям они существенно превзошли обычные микроскопы.

Среди достаточно широкого ассортимента конфокальной оптической аппаратуры каждый пользователь сможет подобрать для себя именно торт микроскоп, который позволит ему активно развивать свои исследования.

Источник: http://www.rumex.ru/information/konfokalnaya-mikroskopiya-princip-deystviya-primery-issledovaniya-351

3.2 Конфокальная микроскопия

Возможности конфокальной микроскопии.(Предварительное сообщение)

Введение.

Конфокальный микроскоп отличается от “классического” оптического микроскопа (см. пункт 3.1) тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы).

Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой (красные лучи на рис.

), проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек (например, синие лучи на рис. 1б) в основном задерживается диафрагмой. Вторая особенность состоит в том, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку (рис.

1в). Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно.

Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом (рис. 1г). Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рис. 1а.  Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца.

Рис. 1б.  Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.

Рис. 1в.  Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку.

Рис. 1г.  Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива
(для подсветки и сбора отраженного сигнала).

Качественно понятно, что применение конфокальной схемы должно приводить к увеличению контрастности изображения, за счет того, что “паразитный” свет от точек соседних с анализируемой перестает попадать в детектор.

Платой за увеличение контрастности будет необходимость применения достаточно сложных схем сканирования либо образцом, либо световым пучком. Детальное рассмотрение существующих технических решений построения конфокальных микроскопов выходит за рамки данного раздела.

Подробности по этому вопросу можно найти в обзорах [1-11].

Разрешение и контрастность в конфокальном микроскопе.

Рассмотрим теперь математически, каким образом и насколько количественно изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Во-первых, так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция размытия точки (далее обозначаемая PSF, см. определение в предыдущем пункте 3.1) имеет вид

(1)

Для качественного понимания удобно рассматривать каждую PSF как вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами , либо что фотон будет зарегистрирован из точки с координатами , тогда конфокальная PSF есть произведение независимых вероятностей. На рис. 2 приведено изображение обычной PSF и конфокальной PSF.

Рис. 2.  Конфокальная PSF показана справа, а обычная PSF – слева [1].

Если использовать критерий Релея для разрешения (провал 26% от максимума распределения), то мы получим, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивается, но не существенно. Для конфокального микроскопа

(2)

в то время как для обычного микроскопа

(3)

где .

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Релея, а существенное увеличение контрастности. В частности для обычной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, для случая конфокального микроскопа это отношение будет 0.04%. На рис.

3 приведен практический пример, когда это важно. На верхней части рисунка мы видим, что тусклый объект (интенсивность в 200 раз меньше, чем у яркого) не возможно обнаружить в обычный микроскоп, хотя расстояние между объектами существенно больше того, что предписано критерием Релея.

В то же самое время, в конфокальный микроскоп (нижняя часть рисунка 3) данный объект должен хорошо регистрироваться.

Рис. 3.  Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок).
Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого [1].

Распределение интенсивности вдоль оптической оси для конфокального микроскопа определяется выражением

(4)

Тогда пользуясь критерием Релея получим разрешение вдоль оптической оси

(5)

Здесь важно отметить, что не следует путать разрешение вдоль оптической оси и глубину фокуса в обычном микроскопе. Обычно глубина фокуса в сотни раз превышает разрешение вдоль оптической оси.

Влияние диафрагмы в фокальной плоскости.

Один из параметров, который никак не фигурировал в данном выше описании – это размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз.

Отметим, что при анализе мы молчаливо предполагали источник точечным и именно в этом предположении получили функцию размытия точки (PSF) для обычного и конфокального микроскопа.

Полученные PSF описывают свойства объективной линзы, а изображение диафрагмы в плоскости объекта определяет, свет из каких областей регистрируется фотодетектором.

Очевидно, однако, что уменьшение размера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходящего света, увеличивает уровень шума и, в конечном итоге, может свести на нет все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, стоит вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с отверстием меньше размера пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разрешение. Диафрагма размером в одно пятно Эйри позволяет по максимуму использовать разрешающую способность объективной линзы.

Однако размер диафрагмы примерно в 3-5 раза больше пятна Эйри представляется наиболее подходящим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от увеличения линзы.

В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Для того, чтобы учесть наличие диафрагмы математически и построить новую функцию распределения интенсивности, следует выполнить свертку

(6)

а для конфокального микроскопа уже полученную функцию умножать на . Результирующее распределение интенсивности для случая диафрагмы с размером 5 пятен Эйри приведено на рис. 4.

Рис. 4.  Функции размытия точки для обычного микроскопа с диафрагмой размером 5 пятен Эйри (верхние рисунки)
и для конфокального микроскопа (нижние рисунки) [1].

Выводы

  • Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения подсветки сфокусированной объективной линзой в область анализа и размещения диафрагмы в плоскости наблюдения перед фотодетектором. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200:1.

  • В конфокальной микроскопии несколько улучшается разрешение в плоскости объекта (в 1.5 раза) и достигается высокое разрешение вдоль оптической оси.
  • Платой за полученные улучшения является необходимость применения схем сканирования, либо путем перемещения образца, либо путем перестройки оптической системы.

    Применение сканирования позволяет увеличить поле зрения по сравнению с обычными оптическими микроскопами.

Литература

  1. Robert H. Webb “Confocal optical microscopy” Rep. Prog. Phys. 59 (1996) 427-471.
  2. Richards B. and Wolf E. “Electromagnetic diffraction in optical systems II. Structure of the image field in an aplanatic system” Proc. R. Soc. A 253 (1959) 358-379.
  3. Kino G. S. and Corle T. R., 1989 Confocal scanning optical microscopy Phys. Today 42 55–62.
  4. Pawley 1991 J B Fundamental and practical limits in confocal light microscopy Scanning 13 184–98.
  5. Shotton D., (ed) 1993 Electronic Light Microscopy—Techniques in Modern Biomedical Microscopy (Wiley-Liss) p. 351.
  6. Slater E. M. and Slater H. S., 1993 Light and Electron Microscopy (Cambridge: Cambridge University Press).
  7. Stevens J. K., Mills L. R. and Trogadis J. (eds) 1993 Three-Dimensional Confocal Microscopy (San Diego, CA: Academic).
  8. Webb R. H., 1991 Confocal microscopes Opt. Photon. News 2 8–13.
  9. Wilson T. 1985 Scanning optical microscopy Scanning 7 79–87.
  10. Wilson T. (ed) 1990 Confocal Microscopy (London: Academic).
  11. Wilson T. and Sheppard C. J. R. 1984 Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy (London: Academic).

Источник: https://www.ntmdt-si.ru/resources/spm-theory/theoretical-background-of-spm/3-scanning-optical-microscopy/32-confocal-microscopy

Поделиться:
Нет комментариев

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Все поля обязательны для заполнения.